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[태그:] BCA Assay

  • MTT assay A+ report

    목차

    1. Introduction
    2. Materials & Methods
    3. Result
    4. Discussion
    5. References

    본문내용

    -Objective
     Hematocytometer를 이용하여 세포 수를 측정하고 계산한다.
     MTT assay 실험 원리를 바탕으로 세포 생존 및 증식을 측정하는 방법을 이해한다.

    -Principle 및 Theory
     Cell counting 시 사용되는 Trypan blue의 입자는 세포막을 확산의 방법으로 통과하여 세포 내부로 유입된다. 살아있는 세포는 ATP 에너지를 이용한 exocytosis로 trypan blue 입자를 다시 세포 외부로 방출하지만, 에너지를 생산할 수 없는 죽은 세포는 exocytosis를 할 수 없어 청색으로 염색된다.
     MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내막을 통과하여 대사적으로 활성을 갖는 세포에 의해 Formazan 결정으로 환원되고, 이는 자주색을 띄는 비수용성의 분자이다. 따라서 DMSO(Dimethyl sulfoxide)와 같은 유기용매에 의해 용해된 Formazan의 흡광도를 통해 세포의 증식과 생존율 및 미토콘드리아의 대사활성을 측정한다.
    가. MTT assay의 원리와 장단점, 응용 가능한 분야에 대하여 조사하시오.
    MTT assay는 세포대사 활성을 색 변화로 측정하는 실험으로 세포 독성 실험이라고도 한다. Tetrazolium salt인 MTT를 살아 있는 세포에 처리하면, 미토콘드리아 안의 oxidoreductase enzyme(NADPH)에 의해 환원되어 보라색을 띠는 formazan 결정체를 형성한다. 죽은 세포의 경우, 미토콘드리아가 터져 없으므로 formazan이 형성되지 않고, 색을 띠지 않는다. 이렇게 생성된 formazan은 비수용성으로, 유기용매 또는 계면활성제 등에 녹여 570nm에서 흡광도(세포의 탈수소효소 환원능력)를 측정한다. 이 때, 흡광도는 살아 있는 세포에 비례하여 증가하게 된다.

    MTT assay의 장점은 세포가 부착된 상태에서 생존도를 비교적 빠르고 쉽게 측정할 수 있으며, 소량의 세포로도 측정 가능하다는 점이다. 하지만 MTT assay가 미토콘드리아 기능을 기반으로 하기 때문에 손상되거나 기능이 이상한 미토콘드리아를 가진 세포의 생존도를 정확하게 반영하지 못할 수 있다는 단점이 있다. 또한, 이 방법은 세포밀도, incubation시간, pH 등의 요인에 영향을 받을 수 있기에 결과의 정확성에 영향을 미칠 수 있다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 세포생리학실험_단백질 검출_BCA assay, 뷰렛반응, 닌히드린 반응

    목차

    Ⅰ. 기본정보
    Ⅱ. 서론
    Ⅲ. 실험재료 및 방법
    Ⅳ. 실험 결과 및 결론
    Ⅴ. 고찰
    Ⅵ. 참고문헌

    본문내용

    Ⅰ. 기본정보
    실험 제목: 단백질 검출
    실험 목적: 단백질에 대해서 알고, BCA assay, 뷰렛반응, 닌히드린 반응을 통해 단백질을 검출한다.

    Ⅱ. 서론
    1. 단백질(protein)
    단백질은 아미노산이 펩티드 결합으로 연결된 복잡한 사슬구조의 고분자 물질이다. 아미노산은 탄소에 아미노기(-NH2)와 카르복실기(-COOH)가 붙어있는 것이 특징이다. 자연계의 20가지의 아미노산은 아미노산이 가지는 R기의 종류에 따라 구분된다. 단백질의 존재를 증명하기 위해서는 발색반응을 사용할 수 있는데, 단백질 분자에 포함된 반응기가 특수한 시약과 어울려서 나타내는 반응이다(김기태 외 4명. 2009).

    2. BCA assay
    알칼리의 조건에서 단백질의 펩타이드 결합과 반응하여 Cu2+가 Cu+로 환원된다. 이후 2분자의 Bicinchoninic acid(BCA)가 환원된 Cu+와 배위 결합해 562nm에서 최대 흡광도를 가지는 강한 보라색을 띤다. Cu+의 생성은 곧 단백질의 농도와 비례하기 때문에 알려지지 않은 샘플의 단백질 함량은 알려진 단백질 표준과 비교하여 분광광도법으로 알아낼 수 있다(Walker, J. M.. 2009).

    3. 뷰렛반응
    뷰렛 시약은 단백질과 폴리펩티드를 검출하기 위해 사용하는 시약이다. 뷰렛시약은 원래 푸른색을 나타내나, 단백질과 반응하면 자주색을 나타내고 짧은 폴리펩티드와 반응하면 분홍색으로 변한다(김기태 외 4명. 2009). 뷰렛은 알칼리성 CuSO4(2가의 구리이온)와 반응하여 보라색의 착화합물을 만든다. 두 개 이상의 펩티드 결합을 가진 화합물도 마찬가지로 유사한 착화합물을 만들며, 단백질의 경우에는 청자색 또는 적자색을 나타낸다. 착화합물의 색은 1-2시간 정도는 안정하게 유지되나, 그 이상에서는 점점 색도가 증가한다(김기태 외 4명. 2009).

    출처 : 해피캠퍼스

  • [일반물리학실험]자외 및 가시분광광도계

    목차

    1. 실험 목적
    2. 실험 이론 및 원리
    3. 실험 기구 및 시약
    4. 실험 방법
    5. 실험 결과
    6. 토의 사항
    7. 참고 문헌

    본문내용

    1. 실험 목적
    단백질은 세포보다도 훨씬 작다. 육안으로는 당연하고 현미경으로도 일일이 몇 개가 있는지 세기는 힘들만큼 작기 때문에 단백질을 정량할 수 있는 분광 광도법이 유용하게 쓰인다. 분광광도법은 효소반응을 연구하고 효소에 대한 약물의 효과를 평가하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들어 클라불란산은 페니실린 G를 페니실로산으로 변환시키는 베타-락타메이즈 효소의 작용을 저해시키는데, 클라불란산의 농도를 높여가면서 흡광도를 측정함으로써 약물의 농도가 증가됨에 따라 약물의 효소 저해에 따른 흡광도의 감소를 관찰하여 클라불란산의 미지의 양을 측정할 수 있다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • BCA assay A+레포트

    목차

    1. Title
    2. Date
    3. Name
    4. Purpose
    5. Materials
    6. Methods
    7. Results
    8. Discussions
    9. Project
    10. Reference

    본문내용

    1. Title
    Protein quantification : BCA assay

    2. Date

    3. Name

    4. Purpose
    단백질 정량 분석 방법 중 colorimetric method의 일종인 BCA assay를 수행하여 표준 단백질의 흡광도를 이용한 표준곡선을 그린 후, 미지의 단백질 시료 농도를 구해본다.

    5. Materials
    Extracted proteins (from MCF-7 cells), Bovine serum albumin (BSA) protein, nuclease free water, BCA reagent A & B, micropipette, tip, rack, 96well plate, 1.5㎖ ep-tube, tissue, 70% EtOH, incubator, plate reader

    6. Methods
    [1] Preparation of standard protein (BSA)
    2㎎/㎖ BSA stock (조별로 80㎕씩 제공됨)으로 serial dilution을 진행하여 7개의 ep-tube에 각각 0, 0.025, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2㎎/㎖ 농도의 BSA을 최소 30㎕씩 준비한다.

    2㎎/㎖
    80㎕(2㎎/㎖ BSA)
    30㎕
    1㎎/㎖
    50㎕(2㎎/㎖ BSA) + 50㎕(D.W)
    60㎕
    0.5㎎/㎖
    40㎕(1㎎/㎖ BSA) + 40㎕(D.W)
    40㎕
    0.25㎎/㎖
    40㎕(0.5㎎/㎖ BSA) + 40㎕(D.W)
    40㎕
    0.125㎎/㎖
    40㎕(0.25㎎/㎖ BSA) + 40㎕(D.W)
    60㎕
    0.025㎎/㎖
    20㎕(0.125㎎/㎖ BSA) + 80㎕(D.W)
    100㎕
    0㎎/㎖
    40㎕(D.W)
    40㎕

    출처 : 해피캠퍼스