목차
1. 실험 목표
2. 실험 원리
1) 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)
(1) PCR 과정
(2) 야생형(Wild type)과 돌연변이형(Mutant type)
2) 반응액의 조성
3) 전기영동 (Electrophoresis)
3. 시약 조사 & 실험 기구 및 방법
1) 실험 시약 및 기구
2) 실험 방법
1. DNA extraction
2. Polymerase Chain Reaction
3. Electrophoresis
4. 실험 시 주의사항
5. 참고 문헌
본문내용
1. DNA extraction
(1) 1/1000으로 희석한 Proteinase을 1㎖씩 E.P tube에 넣는다.
(2) 면봉을 사용해 구강 천장을 긁어 세포를 모으고, 희석한 proteinase solution에 넣는다.
(3) Solution을 37℃ 인큐베이터에서 30분간 incubation 한다.
(4) Incubation 후, 한 샘플 당 4개의 1.5㎖ EP tube에 200uL씩 나눠 담는다.
(5) (4)에서 준비된 tube에 20uL의 sodium acetate와 500uL 100% Ethanol을 각각 첨가한다.
(6) Tube를 15초 정도 Vortexing한 후 -80℃ deep freezer에서 15분간 냉각시킨다.
(7) 15000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리한다.
(8) 상층액을 제거한 뒤, 1㎖의 70% Ethanol을 넣는다.
(9) 15000 rpm, 4℃에서 2분간 원심분리한다.
(10) 상층액을 제거한 뒤 침출된 DNA를 20분간 상온에서 건조시킨다.
(11) 50uL의 DDW로 tube(1)에만 넣어 DNA를 풀어준 뒤, tube(1)의 용액을 다음 튜브로 옮겨 가며 나머지 tube의 DNA를 풀어 하나로 만든 뒤 vortexing해준다.
2. Polymerase Chain Reaction
(1) 한 샘플 당 wild, mutant type 총 2개의 Reaction Mixture(W, M)을 만든다.
Primer mix W: 10uM DNA Forward primer + 10uM DNA Wild Reverse primer
Primer mix M: 10uM DNA Forward primer + 10uM DNA Mut. Reverse primer
(2)Reaction Mixture의 구성성분을 모두 넣고 10uL 이상 파이펫으로 pipetting으로 섞는다.
(3)PCR 기기의 뚜껑을 열고 Reaction Mixture가 든 tube들을 모두 넣고 PCR 전원을 켠 뒤, cycle 수(34X) 및 각 단계의 온도와 시간을 아래대로 설정한 뒤 run을 눌러 시작한다.
3. Electrophoresis
(1) 50x TAE buffer를 1x TAE buffer 500mL가 되도록 증류수로 dilution한다.
(2) (1)에서 만든 1X TAE buffer 500mL 중 50mL를 작은 Bottle에 담아주고, 거기에 Agarose 질량이 1%(w/v)가 되도록 넣어준다.
(3) 뚜껑을 살짝만 닫은 후 충분히 녹을 때까지 전자레인지로 가열한다.
(4) 만졌을 때 따뜻한 정도가 되면 Redsafe를 전체의 1/20000이 되도록 넣는다.
(5) 녹은 agarose 용액을 틀에 천천히 붓고 comb를 꽂은 후 굳을 때까지 기다린다.
(6) 젤이 굳으면 comb를 조심히 뺀 후, 틀에서 gel을 빼내 전기영동기에 넣고 수평을 맞춘 뒤 gel이 다 잠길 정도로 1x TAE buffer를 부어준다.
(7) 각각의 sample에 6X loading buffer가 1X가 되도록 파라필름 위에서 pipetting으로 섞는다.
(8) Agarose gel의 한 well에 DNA marker 5uL를, 나머지 well에 한 well 당 (sample+loading buffer) mixture를 10uL씩 loading한다.
(9) 전기영동기 스위치를 누른 뒤 20분 동안 전기영동을 진행한다.
(10) Gel을 UV-transilluminator로 관찰한다.
출처 : 해피캠퍼스
