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  • 세포생물학실험 만점(A+) 실험 보고서(레포트) 04. MTT assay (WST-8 assay)

    목차

    １.   서론
     
    ２.   실험 목적
     
    ３.   실험 방법
    가.    실험 재료(도구)
    1)      샘플
    2)      시약
    3)      장비
    나.    실험 방법
     
    ４.   실험 결과
     
    ５.   논의 (고찰)
     
    ６.   참고문헌

    본문내용

    １. 서론
    Tetrazolium은 dehydrogenase 등의 효소에 의해 쉽게 환원되어 유색의 formazan을 형성한다. 이러한 원리로 가장 널리 사용되는 MTT tetrazolium은 노란색 수용성 기질로, 미토콘드리아에 있는 reductase에 의해 환원되어 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan 이라고 불리는 crystal을 형성한다. 따라서 세포사멸에 의해 미토콘드리아가 제 기능을 하지 못하게 되면 MTT를 처리해도 formazan을 형성하지 못하게 된다. 이러한 특징을 활용하여 세포 성장 및 독성을 측정하는 MTT assay이 존재한다. MTT assay는 약리학, 독성학 등의 다양한 실험실에서 특정 물질이, 특정한 생물학적, 생화학적 기능을 50% 억제하는데 필요한 양을 나타내는 IC50을 측정하기 위한 용도로 널리 사용되고 있다.

    ２. 실험 목적
    MTT tetrazolium을 이용하여 세포 사멸에 따른 미토콘드리아의 활성도 차이를 관찰한다.

    ３. 실험 방법
    가. 실험 재료(도구)
    ( * 표시는 이전에 작성한 실험 보고서를 참고한다.)
    ① 샘플
    – 마우스 종양 세포 4T1(Triple Negative Breast Cancer(TNBC))*
    ② 시약
    – cell culture media (10% FBS, 1% P/S) *
    – CCK-8(#K1013,APExBIO)
    CCK-8는 ‘Cell Counting Kit 8’의 약자로, CCK-8 속 함유되어 있는WST-8을 이용하여 세포 생존율, 세포 독성 등을 측정하는 물질이다. WST-8는 테트라졸리움(Tetrazolium) 계열의 구성물질로, 살아있는 세포에서 미토콘드리아 탈수소효소(dehydrogenase)에 의해 환원되어서 오렌지 계열의 포르마잔(formazan)을 형성한다. 이때, 생성된 포르마잔은 수용성이고, 쉽게 용해되는 특성을 지니고 있다.
    즉, 미토콘드리아의 활성 측정을 통해서, 실험에 사용한 화합물이 세포에 얼마나 독성을 나타내는지 확인하는 것이다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 이화여자대학교 생과실3 A+ report

    목차

    1. Introduction
    2. Materials & Methods
    3. Results
    4. Discussion

    본문내용

    -Objective
    이 실험은 면역 반응 중 B cell의 Antibody 생성을 통해 이루어지는 체액성 면역 반응에 대해 다룬다.이 실험의 목적은 Stimulator 조건에서 WEHI cell(mouse B cell)에 TD antigen과 TI antigen을 넣고 B세포를 활성화시킨 후, sandwich ELISA technology로 B세포에서 분비된 항체의 농도를 standard curve를 통해 측정하는 것이다.

    -Principle 및 Theory
    가. B lymphocyte activation의 과정
    체액성 면역반응은 비장, 림프절 등에서 특이적 항원과 만나 결합한 B cell이 그 항원에 대한 항체를 생성하여 분비하면 그 항체가 체내를 돌아다니는 방식으로 진행된다. 이를 통해 T cell을 비롯한 각종 선천 및 후천 면역반응의 면역세포가 활성화된다. 체액성 면역반응에는 크게 T cell과 B cell이 관여한다. B cell은 Bone marrow(BM)에서 생성되고 성숙하는 반면, T cell은 BM에서 생성되어 Thymus에서 성숙한다. 활성화된 B cell은 class switching과 친화력 성숙과정을 거쳐 plasma cell과 memory cell로 분화한다. Plasma cell이 직접적으로 antibody를 분비하고, memory cell은 antibody를 세포표면에 부착시킨 채로 존재하여 다음에 같은 항원이 재차 침입했을 때 빠르게 반응할 수 있는 면역적 기억을 형성한다.
    B세포는 활성화되면서 증식하게 되는데, 결과적으로 클론확장과 분화가 일어나며, 항체를 생산하는 plasma cell과 memory B cell이 생성된다. 항원은 naïve 성숙 B cell의 IgM, D와 결합하여 B cell을 활성화시킨다. B cell의 activation은 Antigen specific cell의 증식과 분화를 이끌고, memory B cell과 Antibody 분비 plasma cell이 되도록 만든다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 생명과학실험 ELISA 실험 레포트

    목차

    1. Introduction
    ◼ 실험 목적
    항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하는 ELISA방법 및 원리에 대해 이해하고,
    antibody농도에 따른 흡광도를 나타내는 4PL curve를 이용해 antibody가 antigen
    에 얼마나 강하게 붙었는지 알 수 있다.
    ◼ 이론
    ① 항원-항체반응
    ② ELISA
    1) Direct ELISA (직접 ELISA)
    2) Indirect ELISA
    3) Sandwich ELISA
    4) Competitive ELISA
    ③ 4PL Regression

    2. Methods

    3. Result

    4. Discussion

    5. Reference

    본문내용

    ◼ 실험 목적
    항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하는 ELISA방법 및 원리에 대해 이해하고,
    antibody농도에 따른 흡광도를 나타내는 4PL curve를 이용해 antibody가 antigen
    에 얼마나 강하게 붙었는지 알 수 있다.
    ◼ 이론
    ① 항원-항체반응
    항체(antibody) 또는 면역글로불린(immunoglobulin,Ig)은 항원(antigen)과 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질이다. 가장 대표적인 항체에는 면역글로불린G(Immunoglobulin G)가 있다. 이런 항체의 기본 구조는 Y자 모양이며, heavy chain 2개와 light chain 2개가 비공유결합과 이황결합으로 연결된 4개의 폴리펩타이드를 가지고 있다. IgG의 Y자 모양의 가지부분과 받침부분을 나누는 부분을 경첩이라고 하는데, 이 경첩영역을 기준으로 가지부분은 Fab, 받침부분은 Fc영역으로 나눈다. 항체는 세균이나 바이러스 같은 외부 항원과 단단하게 특이적으로 결합한다
    항원-항체반응은 면역 체계에서 세균이나 바이러스 같은 외부항원들과 특이적으로 결합해 항원을 인식하게하고 무력화시키기 위한 항원과 항체 사이의 특정한 화학 상호작용을 말한다. 항원-항체 결합의 특이성은 전하, 극성, 비극성, 수소결합 등이 다른 잔기들의 위치와 형태에 따라 항원과 항원결합자리 사이의 화학적 상보성을 부여 받아 얻게 된다. 항원과 항체의 결합은 유도적합(induced fit)에 의해 각각의 상보성 잔기들이 충분히 상호작용할 수 있도록 일어난다.

    ② ELISA
    – ELISA란?
    ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)는 antigen-antibody interaction을 이용해 antigen이나 antibody를 정성, 정량화할 수 있는 실험법이다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • Enzyme Activity- Colorimetric of Catalase

    목차

    I. Introduction
    1. Enzyme
    2. Catalase
    3. 흡광, 형광, 발광의 원리
    4. 표준 검정 곡선법 (standard calibration curve methods)
    5. 실험 원리 : 남은 h2o2양을 감별하여 catalase농도 인지 / 줌크로산염+아세트산 -> cromatic acid
    6. Dichromate/Acetic acid (D/A)

    II. Materials

    III. Method

    IV. Result

    V. Discussion
    1. 0.6unit과 0.8unit의 결과가 바뀐 듯한 양상을 보임
    2. sample 1, 2 끼리 유의미한 차이가 없음
    3. 시약 계산 원리
    4. 실험 중 주의 사항

    본문내용

    1. Enzyme

    효소(enzyme)란 생체 내의 화학반응을 매개하는 단백질 촉매이다. 효소와 결합하는 특이적 반응물을 기질(substrate)이라고 하고 기질과 반응하여 활성화 에너지를 낮춰 반응을 촉진 시킨다. 기질의 입체구조와 효소의 활성부위가 맞아야 결합하여 반응이 일어나고 이를 기질특이성을 가졌다고 한다. 효소는 결국 단백질이므로 3차구조에 중요한 온도, pH 등 환경 조선이 활성 정도에 영향을 미친다.

    촉매 작용에는 총 네가지 정도의 방법이 있는데 다음과 같다.
    1) 특이적 산-염기 촉매 작용 : 물속에 존재하는 H+또는 OH-이온만을 사용하는 촉매
    2) 일반적 산-염기 촉매 작용 : 다른 분자가 양성자 전이에 관여하여 작용
    3) 공유결합성 촉매 작용 : 효소와 기질 사이 일시적인 공유 결합이 형성
    4) 금속이온 촉매 작용 : 효소에 결합된 금속과 기질 간 이온의 상호작용을 일으킴

    2. Catalase

    카탈레이스는 O2 대사 동안 생성된 과산화수소에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 금속 효소이다. 과산화수소를 물과 산소로 분해함으로써 세포를 보호한다. 몸 속에 있는 H2O2는 체내에 있는 다른 금속 이온과 반응하여 hydroxyl radical을 만들 수 있다. hydroxyl radical은 반응성이 매우 커서 체내에서 순간적으로 반응할 수 있다. 이는 안정된 세포를 손상시킬 수 있기에 과산화수소를 체내에서 제거하는 것은 매우 중요하다고 볼 수 있다.

    3. 흡광, 형광, 발광의 원리
    1) 흡광(absorbance)

    흡광은 샘플에 의해 흡수된 빛의 세기를 측정하는 방법이다. 화학물질은 각각 고유의 값으로 잘 흡수하는 파장이 있다. 따라서 흡수된 빛의 세기를 측정한 다음 이를 통해 어떤 화합물이 많은지 측정할 수 있다.

    2) 형광(fluorescence)
    물질이 빛의 자극에 의하여 에너지 준위가 올라갔다가 다시 고유의 에너지 상태로 돌아가기 위해 빛을 발산하는 현상을 말한다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 면역학 ELISA 실험 레포트

    목차

    1.실험제목(title)
    2.실험날짜(date):
    3.실험목적(purpose):
    4.실험 준비물(material-reagent, instrument)
    5.실험 방법(method)
    6.실험 결과(result)
    7.실험 고찰(discussion)
    8.참고문헌(reference)

    본문내용

    · 실험 제목(title): ELISA assay(mouse macrophagy from bone marrow)

    · 실험날짜(date):

    · 실험목적(purpose): 항원-항체 특이적 결합반응과 효소를 이용한 발색반응을 통해 target을 정성, 정량적으로 분석하는 방법을 익히기 위함이다.

    · 실험 준비물(material-reagent, instrument)
    pipet, assay diluent, tip, L929 sup와 LPS를 모두 처리한 well의 상층액, PBST, working detector(Detection Antibody+SAv-HRP reagent), stop solution(H3PO4),

    · 실험 방법(method)
    ① coating과 blocking과정을 거친 well을 준비한다.

    출처 : 해피캠퍼스