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  • 인천대학교 나노바이오실험(1) A 자료) 6. Genomic DNA prep & Gel Electrophoresis

    목차

    1. 실험 일시 및 장소
    2. 실험 도구
    3. 이론
    4. 실험 목표
    5. 실험 방법
    6. 결과
    7. 고찰
    8. 출처

    본문내용

    2. 실험 도구
    – Sample : mouse tail
    – 실험 기자재 : 마이크로 피펫 & 마이크로 피펫 팁, EP tube , tube rack, 라텍스 장갑, nanodrop, UV lamp, 전기영동장치, shaking incubator, centrifuge
    – 시약 : lysis buffer(1M Tris HCl, 0.5M EDTA, 010% SDS, 5M NaCl), proteinase K, isopropanol, agarose powder, 1X TAE buffer, 70% DEPC-EtOH, DNA size marker, DW, 6X loading dye, gel electrophoresis buffer, EtBr

    3. 이론
    ① Genomic DNA
    Genomic DNA는 긴 이중사슬로서 세포 핵 내에 존재한다. 게놈 DNA 또는 gDNA는 유기체의 염색체 DNA로 유전 물질의 대부분을 나타낸다. 세포가 본래 가지고 있는 DNA로, 외부에서 들어온 plasmic DNA같은 extra genomic DNA가 아닌 chromosome DNA이다. 세포가 살아가는데 필요한 모든 유전정보들을 담고 있는 DNA이다. 진핵세포 생물의 경우, 핵 내에 존재하는 chromosome DNA 뿐만 아니라, 미토콘드리아나 엽록체 genomic DNA를 모두 포함하기 때문에 진핵세포가 가지고 있는 total genomic DNA를 의미하기도 한다.
    ② DNA 추출
    Genomic DNA와 plasmic DNA 추출의 기본 원리는 같으나, plasmid DNA는 genomic DNA로부터 plasmid를 분리하기 위한 단계를 거쳐야 한다. 세포로부터 DNA 추출은 크게 세포의 수확(cell harvest), 세포의 파괴(cell lysis), DNA 추출과 정제(DNA purification)의 과정으로 나뉜다.
    1) 세포의 수확 : 일반적으로 원심분리를 이용하여 세포를 수확한다.
    2) 세포의 파괴
    세포로부터 DNA를 분리하기 위해서는 세포 내 DNA가 세포 밖으로 유출될 수 있도록 세포벽, 세포막을 분해해야한다. 이는 물리적, 화학적 방법으로 나뉜다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 인천대학교 나노바이오실험(1) A 자료) 5. Restriction Enzyme Cutting

    목차

    1. 실험 일시 및 장소
    2. 실험 도구
    3. 이론
    4. 실험 목표
    5. 실험 방법
    6. 결과
    7. 고찰
    8. 출처

    본문내용

    2. 실험 도구
    – 실험 기자재 : 마이크로 피펫 & 마이크로 피펫 팁, EP tube , tube rack, 라텍스 장갑, microwave, UV lamp, 전기영동장치, shaking incubator, vortex mixer, centrifuge, 스티로폼 박스, 삼각플라스크
    – 시약 : Plasma DNA, Not Ⅰ, Hind Ⅲ, 10X fast cut buffer, DNA marker, DW, agarose powder, TAE buffer, 6X loading dye, gel electrophoresis buffer, EtBr, ice

    3. 이론
    ① Restriction enzyme
    세균이 바이러스 등 외부에서 온 DNA를 절단하여 배제시키기 위해서 가지고 있는 일종의 자기방어효소이다. DNA의 염기 서열의 특정 부분만을 가수분해하는 성질을 가진 것으로, 유전공학에서 유용한 수단으로 이용될 수 있다. 제한효소는 이들의 조성과 필요로 하는 효소 보조인자, 이들이 작용하는 서열에 따라 크게 4개의 그룹으로 나눌 수 있다. 모든 제한효소는 DNA 내부에 존재하는 짧은 서열을 인지하여 작용한다.
    Type Ⅰ의 경우 제한효소와 메틸화효소가 뭉쳐져 있고, 인식자리와 제한자리가 서로 다르다. 염기서열은 특이적으로 인식하지만, 인식자리에서 약 1000개 염기 정도 떨어진 곳에서 비특이적으로 DNA를 자른다. 또한, 활성에 ATP나 S-아데노실메티오닌, Mg2+ 등을 필요로 한다. DNA 절단 위치의 특이성이 없기 때문에 실험 목적으로는 거의 사용하지 않는다.
    Type Ⅱ는 인식자리가 특이적이고 제한자리 또한 주변의 염기로 특이적으로 작용한다. 실험실에서 주로 사용하는 것이 이 유형이다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 인천대학교 나노바이오실험(1) A 자료) 4. Plasmid perp & Gel Electrophoresis

    목차

    1. 실험 일시 및 장소
    2. 실험 도구
    3. 이론
    4. 실험 목표
    5. 실험 방법
    6. 결과
    7. 고찰
    8. 출처

    본문내용

    2. 실험 도구
    – 실험 기자재 : 마이크로 피펫 & 마이크로 피펫 팁 (1000 μL, 200 μL), tube (10 mL, 50 mL), tube rack, 라텍스 장갑, microwave, UV lamp, nano drop, 전기영동장치, shaking incubator, vortex mixer, centrifuge, 스티로폼 박스, 삼각플라스크
    – 시약 : E.coli 배양액, agarose powder, TAE buffer, 6X loading dye, isopropanol, 70% EtOH, gel electrophoresis buffer, EtBr, DW, P1, P2, P3 solution, ice

    3. 이론
    ① Plasmid DNA
    세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA이다. 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다.
    ② Plasmid DNA를 추출하는 방법
    Ⅰ. 크기 차이를 이용한 plasmid 추출 및 정제 방법
    유전체 DNA가 절단되지 않도록 매우 조심히 수행하여야 한다. 먼저, EDTA, 라이소자임 및 25% 자당(sucrose) 용액을 처리하여 세포벽이 부분적으로 파괴된 원형질체를 형성한 후, 비이온성 계면활성제인 Triton X-100을 첨가하여 세포를 용해시킨다. 이후, 원심분리를 통해 상층액에 있는 플라스미드를 추출하게 된다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • (실험보고서) PCR product를 전기영동으로 확인하기

    목차

    I. Purpose
    II. Introduction
    III. Materials
    IV. Methods
    V. Results
    VI. Discussion
    VII. Reference

    본문내용

    I. Purpose
    유전자 확보를 위해 PCR을 수행하고, agarose gel electrophoresis를 통해 PCR로 증폭된 DNA를 확인
    하며, 제한효소처리와 cloning을 위해 PCR nucleotide만 정제하기 위한 PCR purification을 한다.
    II. Introduction
    1. PCR 기본원리
    1-1. 준비물:
    복제할 DNA 서열(template), Primer, DNA nucleotide, Taq DNA
    polymerase, DNA 중합효소용 완충용액
    1-2. 순서:
    (1) Denaturation (92~95℃) : DNA 가닥 분리를 위한 열처리 단계
    (2) Annealing (50~65℃) : primer 결합을 위해 식히는 단계
    (3) Elongation (70~74℃) : DNA polymerase가 DNA를 연장함

    출처 : 해피캠퍼스