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  • 제한효소를 이용한 DNA절단&전기 영동법 및 PCR에 의한 DNA분리 및 확인

    목차

    1. 실험제목

    2. 실험목적

    3. 실험 기구 및 시약

    4. 실험원리
    4.1 PCR
    4.2 전기영동
    4.3 competent cell
    4.4 유전자 재조합
    4.5 형질전환
    4.6 Ethidium Bromide

    5. 실험 방법

    본문내용

    1. 실험제목: 제한효소를 이용한 DNA절단& 전기 영동법 및 PCR에 의한 DNA분리 및 확인

    2. 실험목적: 미생물에서 plasmid DNA를 분리하고, PCR을 이용하여 DNA를 증폭하고 제한효소를 이용하여 DNA를 절단한 후 Mini gel unit를 이용하여 전기영동법에 의해 DNA를 분리하고 확인한다.

    3.실험 기구 및 시약
    Gradient PCR, Mini Gel Electrophoresis Units(Mupid21), agarose gel, Microcentrifuge tube, 증류수, 제한효소, buffer용액, PCR premix tube, 증류수, primer, DMSO, 주형 DNA, size marker, circular vector plasmid, loading dye, circular recombinent plasmid

    4. 실험원리

    4.1 PCR
    1. PCR의 원리
    PCR법의 기본 원리는 다음과 같다.
    첫 단계는 이중쇄 DNA를 단일쇄 DNA로 열변성(denaturation)시킨다. 두 번째 단계는 올리고 뉴클레오티드를 단일쇄 DNA에 결합(annealing)시키고 세 번째 단계는 결합한 올리고뉴클레오티드를 시발체로 하여 DNA 폴리머라제에 의해 DNA를 합성(Extension)하여 이상의 과정을 일정한 싸이클동안 반복한다.
    이론적으로 매 PCR 주기마다 증폭되는 DNA는 2배씩 늘어나야 하나 (n 싸이클 후는 2n개) 여러 가지 이유에서 일정 주기가 지나면 증폭되는 DNA의 양이 안정기(plateau)에 도달하게 된다. PCR로 증폭된 밴드를 에티디움 브로마이드(EtBr)로 염색된 아가로스 젤(Agarose gel)에서 관찰하려면 약 50ng의 DNA가 필요한데 50ng은 300bp길이 DNA로 따지면 약 1011카피가 된다. 따라서 단일 copy의 300bp DNA를 증폭 후 전기영동하여 볼 수 있으려면 약 37 싸이클이면 (237=1011)된다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • (실험보고서) PCR product를 전기영동으로 확인하기

    목차

    I. Purpose
    II. Introduction
    III. Materials
    IV. Methods
    V. Results
    VI. Discussion
    VII. Reference

    본문내용

    I. Purpose
    유전자 확보를 위해 PCR을 수행하고, agarose gel electrophoresis를 통해 PCR로 증폭된 DNA를 확인
    하며, 제한효소처리와 cloning을 위해 PCR nucleotide만 정제하기 위한 PCR purification을 한다.
    II. Introduction
    1. PCR 기본원리
    1-1. 준비물:
    복제할 DNA 서열(template), Primer, DNA nucleotide, Taq DNA
    polymerase, DNA 중합효소용 완충용액
    1-2. 순서:
    (1) Denaturation (92~95℃) : DNA 가닥 분리를 위한 열처리 단계
    (2) Annealing (50~65℃) : primer 결합을 위해 식히는 단계
    (3) Elongation (70~74℃) : DNA polymerase가 DNA를 연장함

    출처 : 해피캠퍼스

  • 생명과학실험 PCR 유전자 증폭 예비 레포트

    목차

    1. 서론
    2. 실험 재료 및 방법
    3. 참고 문헌

    본문내용

    1. 서론
    1) 실험 목적: PCR의 원리와 목적을 이해하고 PCR에 의한 유전자 증폭에 대해 알아본다.
    2) 배경지식
    (1) PCR(Polymerase Chain Reaction): 중합효소 연쇄반응으로도 불리는 PCR은 단백질(표적 핵산)을 증폭해서 검출하는 검사법으로, 두 개의 primer(시발체) 사이에 낀 DNA를 시험관 내에서 대량(20만~50만배)으로 증폭시킬 수 있는 혁명적인 방법이다. 실험 과정이 복잡하지 않아, 생물의 분류나 의료(유전병 진단), 범죄 수사(DNA 지문 분석) 등 DNA를 취급하는 작업에서 중요하게 사용되고 있다.
    (2) PCR 과정: PCR은 총 3가지 단계로 이루어지는데, DNA의 해리(denaturation), primer와 주형 DNA의 결합(Annealing), DNA의 신장(Extension)으로 구성되어 있다. 이 3가지 단계를 하나의 cycle로 하는데, 1 cycle마다 기존 DNA의 2배가 되기에 증폭될 때 2의 제곱으로 증폭이 된다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • [생화학실험] A+, PCR 및 agarose gel 전기영동 실험

    목차

    1. 실험목적
    2. 이론
    3. 실험재료 및 기기
    4. 실험과정
    5. 실험결과
    6. 고찰
    7. Reference

    본문내용

    [ 실험목적 ]
    – PCR의 원리를 이해하고, 겔을 직접 제조해본 뒤 전기영동 하여 DNA를 분리한다.
    – DNA ladder의 band와 비교하여 증폭된 PCR product의 크기를 측정한다.

    [ 이론 ]

    1. PCR (Polymerase Chain Reaction)
    – PCR은 원하는 DNA band만을 증폭 가능하며, 이때 DNA polymerase가 사용된다.
    – 30-40 cycle 정도 반복
    – 증폭하고자 하는 표적 DNA의 한 DNA 사슬 3’말단에 상보적인 것과 그 반대 사슬의 3‘말단에 상보적인 2개의 특
    정 올리고데옥시뉴클레오티드 합성 → 이 올리고데옥시뉴클레오티드를 원하는 절편을 함유한 변성된 한 가닥의 표
    적 DNA와 혼성화 반응 시킨다.
    (DNA polymerase는 Taq DNA polymerase 사용하며, 이는 열에 안정성이 있는 DNA polymerase이다.)
    – PCR이 끝난 product를 분석하기 위해 전기영동을 진행한다.
    – 반응에 아주 소량의 시료로 원하는 부분만 증폭가능하며, 정확도가 높다.
    – DNA 지문검사, 혈연 관계 확인, 클로닝 기법 등에 사용된다.


    1) Template DNA
    • 증폭 대상이 되는 DNA. 일반적인 PCR의 경우 DNA를 사용하고, PCR 이전단계에서 Reverse Trans
    cription을 행했을 경우 Reverse Transcription이 끝난 cDNA를 사용한다.
    2) 한 쌍의 primer

    출처 : 해피캠퍼스

  • 미생물 면역학 실험보고서

    목차

    1. Preparation of media (LA/LB & TGY broth-agar)
    2. Bacteria cell culture
    3. Genome prep (Genomic DNA extraction)
    4. PCR for 16S rRNA sequencing
    5. Agarose gel Electrophoresis
    6. DNA sequencing analysis
    7. Measurement of CFU
    8. Isolation of non-pigment colonies
    9. PCR for carotenoid genes
    10. Plasmid mini prep
    11. Transformation
    12. Data analysis

    본문내용

    -실험과정
    -Cell harvesting for Gram-Positive bacteria
    1. 70°C incubator를 미리 켜서 온도를 올려 놓는다.
    2. Lysozyme buffer (sample 당 0.004g lysozyme + 200μl (마이크로리터; λ = 람다) GPT buffer) 를 준비한다.
    3. 유전체를 뽑고자 하는 균을 overnight-culture(12~16h)시킨 후, EP-tube에 1.5ml씩 담고 2분간 centrifuge 시킨다. 그 후, 상층액을 모두 버린다.
    4. Lysozyme buffer 200μl를 넣고, pipetting으로 잘 섞어준다.
    5. 10분간 실내온도로 incubation시킨다. (2~3분마다 가볍게 흔들어줄 것)
    -Cell lysis : Lysis buffer는 세포막을 깨는 용도
    6. GB buffer 200μl를 넣고, 5초간 pipetting 해준다.
    7. 70°C incubator에 준비한 sample을 넣고 10분간 incubation시킨다. (3분마다 가볍게 흔들어줄 것) 이때, D.W를 70°C incubator에 넣어둔다.(elution) 그리고 Collection tube에 GB Column을 미리 끼워 넣고, labeling한다.
    -DNA Binding
    8. 에탄올 (96~100%) 200μl를 넣고, 즉시 vortexing으로 10초간 섞어준다.
    9. EP-tube에 담긴 sample을 준비한 GB Column에 넣는다.
    10. cap을 닫고 2분 30초간 centrifuge (14,000-16,000 x g) 시킨다. 그 후, 걸러진 액체를 버린다.
    -Wash : Column과 Bead에 부착된 DNA 떨어뜨리기
    11. W1 Buffer 400μl를 GB Column에 넣은 후, 2분간 centrifuge (14,000-16,000 x g) 시키고 걸러 진 액체를 버린다.
    12. (에탄올이 첨가된) Wash Buffer 600μl를 GB Column에 넣는다. 2분간 centrifuge (14,000- 16,000 x g) 시키고 걸러진 액체를 버린다.

    출처 : 해피캠퍼스