지식참고자료

[태그:] Plasmid DNA

  • 세포생리학실험_Plasmid DNA 정제

    목차

    Ⅰ. 기본정보
    Ⅱ. 서론
    Ⅲ. 실험재료 및 방법
    Ⅳ. 실험 결과 및 결론
    Ⅴ. 고찰
    Ⅵ. 참고문헌

    본문내용

    Ⅰ. 기본정보
    실험 제목: Plasmid DNA 정제
    실험 목적: Plasmid DNA에 대해서 알고, Alkaline lysis method를 통해 Plasmid DNA를 정제한다.
    실험자:

    Ⅱ. 서론
    1. E. coli
    대장균(E.coli)은 Theodor Esherich의 이름을 따서 발견되어 명명된 박테리아이다. 특징으로는 그람음성의 간균이며, 포자 생성을 하지 않으며, 1-2 microns x 30-30 micron (1 micron = 0.001 mm)크기이고, 섭씨 37도에서 쉽게 자랄 수 있다(Viroj Wiwanitkit, 2011). 대장균(E.coli)은 원핵생물에 속하며, Plasmid DNA를 가지고 있다(심규철 외 5명).

    2. Plasmid DNA
    Plasmid DNA란 세균 속에 주 DNA와 별도로 존재하면서 증식할 수 있는 고리 형태의 DNA로, 원핵생물과 효모 등에서 발견된다(심규철 외 5명). 대장균 세포에서 분리된 Plasmid DNA는 supercoiled 형태로, 압축되어 존재한다. 이는 대장균의 DNA 길이가 대장균의 몸 크기보다 더 길기 때문에, 최대한 압축되어 세포안에 존재하기 위함이다(Klug et al.. 2017).

    출처 : 해피캠퍼스

  • 제한효소와 아가로즈젤 전기영동/ Restriction Digest and Agarose Gel Electrophoresis

    목차

    1. Summary
    2. Introduction
    3. Material and Methods
    4. Result and Discussion
    5. Reference

    본문내용

    1) Plasmid DNA

    Plasmid DNA는 재조합 DNA 조작을 위한 운반체 DNA로 사용되는데, 이 운반체 DNA를 Vector라고 한다. 주로 대장균에 vector를 삽입하는데 이 과정을 Bacterial Transformation이라고 한다. vector를 cell에 도입한 뒤, 선별을 위해 ampicillin이 함유된 배지에서 키우는 과정을 진행한다. ampicillin이 함유된 배지에서 자라난 colony는 Bacterial Transformation이 성공한 cell이다. 대장균 cell에는 plasmid DNA와 대장균 cell의 염색체 DNA인 chromosomal DNA가 독자적으로 존재하기 때문에 plasmid DNA를 따로 분리하여야 한다. cell에서 plasmid DNA를 따로 분리하는 과정을 Purification of plasmid DNA라고 한다. plasmid DNA 분리에는 boiling method, alkaline lysis, lithium based procedure 등 여러 방법이 있지만 가장 보편적으로 사용되는 방법은 alkaline lysis이다. 높은 pH의 알칼리성 용액을 사용하여 cell의 세포벽과 세포막을 용해시킨 후, 산성 용액을 처리하여 plasmid DNA만을 분리해내는 방법이다. 알칼리성 용액이 cell을 용해시키면 cell 안의 chromosomal DNA와 수확해야 할 plasmid DNA가 노출되어 변성이 일어나게 된다. 두 DNA 모두 변성이 일어나지만 산성 용액을 이용하여 용액을 중성으로 만들어주면 원래의 변성 전 상태로 복원이 된다. 하지만 chromosomal DNA는 크기가 크고 구조가 복잡하여 변성 전의 상태로 복원이 되지 못하고 침전이 되어 제거되며, plasmid DNA는 비교적 간단한 구조이기 때문에 원래 상태로 복원되게 된다. 분리가 끝난 plasmid DNA는 Electrophoresis를 통해 확인할 수 있다. 이렇게 분리한 plasmid DNA는 Electrophoresis로는 원하는 DNA 서열이 잘 나왔는지 알 수 없다. 일반적으로 Restriction enzymes를 처리하지 않은 plasmid DNA의 경우 open circular DNA, supercoiled plasmid DNA가 많이 관찰되며 Restriction enzymes를 처리하면 linear plasmid DNA가 관찰된다. open circular DNA는 DNA의 이중나선 구조 중에 한 가닥이 끊어져 super coil이 끊어진 구조를 말하며 Nick이라고도 한다. 이 구조를 가진 plasmid DNA를 Electrophoresis하면 3가지 구조 중 가장 얇은 형태의 band가 관찰된다. linear plasmid DNA는 Restriction enzymes를 처리했을 때 나타나며 circular 구조에서 두 가닥 모두가 끊어져 선형이 된 구조를 말한다. 이 구조는 supercoiled plasmid DNA보다는 얇은 band를 형성하게 된다. supercoiled plasmid DNA는 이중나선 구조의 DNA가 더 뒤틀리면서 초나선 구조를 형성한 것을 말한다. 이 DNA는 Electrophoresis 시 가장 두꺼운 밴드를 형성하며 뒤틀림 구조에 따라 모양도 제각각인 것을 알 수 있다. 따라서 restriction enzymes을 처리해서 원하는 DNA 서열만을 잘라내야 얼마나 수확했는지를 알 수 있게 된다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 세균의 형질전환 / bacterial transformation

    목차

    1. Summary
    2. Introduction
    3. Material and Methods
    4. Result and Discussion
    5. Reference

    본문내용

    1) Genetic Recombination

    유전자 재조합은 서로 다른 genome에서 얻은 유전자를 한 세포로 몰아서 돌연변이 없이 새로운 유전형질을 가진 cell을 만드는 과정이다. 유전자 재조합 방법에는 우리가 실험한 transformation, transduction, conjugation이 있다.

    Transformation, 즉 형질전환은 세포에 외부 유전자를 인공적으로 도입시켜 숙주세포에 넣어서 세포가 원래의 특성이 아닌 다른 유전형질을 갖도록 하는 것이다. 따라서 외부로부터 들어온 DNA에 의해 숙주세포의 유전적 형질이 변하게 되는데, 예를 들어 협막을 가진 S형균에서 DNA를 추출하여 협막을 가지지 않은 R형균에 넣게 되면 R형균의 일부가 S형균으로 변하게 된다. 이는 R형 균에 들어간 S형균의 유전자가 발현했기 때문이다. 여기서 협막은 다당류로 이루어진 두꺼운 막을 말하며 세균의 내부와 외부를 구분해주는 세포 껍질 바깥에 위치한다.

    transduction(형질도입)은 일반 형질도입과 특수 형질도입으로 나뉜다. 일반 형질도입은 보편적인 형질도입의 형태로, 숙주세포가 감염이 되어 DNA가 여러 조각으로 분리되고 그 일부인 DNA 단편이 파지 속으로 들어간 경우를 말한다. 이런 파지 입자는 다른 세포를 감염시킬 때 이전 세포의 DNA의 일부를 세포 내부로 주입하게 되는데, 주입된 DNA가 원래의 DNA와 재조합이 될 수 있다. 특수 형질도입은 파지가 세포를 감염시킨 뒤 숙제세포의 염색체 특정 부위에 파지의 DNA를 넣어 용혈과정에서 파지 DNA와 세포 DNA가 분리되어 캡시드 단백질과 조합될 때 파지가 세포 DNA의 일부를 가져가는 과정을 통해 이전 세포의 DNA가 다른 세포로 전달되게 된다.

    conjugation은 접합이라고도 하며 요약하면 세포 간 직접적인 접촉에 의해 DNA가 이동하여 전달되는 현상이다. conjugation은 직접적으로 세포 사이의 연결을 통하여 세균 세포들끼리 유전 물질을 전달하는 것을 말한다.

    이 실험에서 사용된 외부 DNA는 vector라고 한다. Vector는 형질전환 시에 운반체로 사용되며 염색체와는 다른 별도의 DNA로, 자기복제가 가능하며 double-stranded 구조를 가진다. plasmid DNA는 자신을 가진 세포에 주요 이점을 제공하는 단백질을 만드는 유전 정보를 지닌 경우가 많다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 플라스미드 DNA 정제/ purification of plasmid DNA

    목차

    1. Summary
    2. Introduction
    3. Material and Methods
    4. Result and Discussion
    5. Reference

    본문내용

    1) Plasmid DNA 분리

    Plasmid DNA는 재조합 DNA 조작을 위한 운반체 DNA로 사용되는데, 이 운반체 DNA를 Vector라고 한다. 주로 대장균에 vector를 삽입하는데 이 과정을 Bacterial Transformation이라고 한다. vector를 cell에 도입한 뒤, 선별을 위해 ampicillin이 함유된 배지에서 키우는 과정을 진행한다. ampicillin이 함유된 배지에서 자라난 colony는 Bacterial Transformation이 성공한 cell이다. 대장균 cell에는 plasmid DNA와 대장균 cell의 염색체 DNA인 chromosomal DNA가 독자적으로 존재하기 때문에 plasmid DNA를 따로 분리하여야 한다. cell에서 plasmid DNA를 따로 분리하는 과정을 Purification of plasmid DNA라고 한다. plasmid DNA 분리에는 boiling method, alkaline lysis, lithium based procedure 등 여러 방법이 있지만 가장 보편적으로 사용되는 mini-prep 방법은 alkaline lysis이다. 높은 pH의 알칼리성 용액을 사용하여 cell의 세포벽과 세포막을 용해시킨 후, 산성 용액을 처리하여 plasmid DNA만을 분리해내는 방법이다. 알칼리성 용액이 cell을 용해시키면 cell 안의 chromosomal DNA와 수확해야 할 plasmid DNA가 노출되어 변성이 일어나게 된다. 두 DNA 모두 변성이 일어나지만 산성 용액을 이용하여 용액을 중성으로 만들어주면 원래의 변성 전 상태로 복원이 된다. 하지만 chromosomal DNA는 크기가 크고 구조가 복잡하여 변성 전의 상태로 복원이 되지 못하고 침전이 되어 제거되며, plasmid DNA는 비교적 간단한 구조이기 때문에 원래 상태로 복원되게 된다. 분리가 끝난 plasmid DNA는 Electrophoresis를 통해 확인할 수 있다.

    2) Alkali lysis

    Alkali lysis는 mini-prep의 한 종류로 용액의 pH를 이용하여 plasmid DNA를 분리하는 방법이다. 여기서 mini-prep은 DNA purification의 한 종류로 mini는 DNA를 소량 추출한다는 뜻이며 prep은 preparation을 의미한다. Alkali lysis는 Re-suspension, Cell lysis, Neutralization, Cleaning and Concentration 순서로 진행하게 된다. Re-suspension 단계에서는 S1 buffer를 사용하게 되는데, 이 buffer는 glucose, EDTA(chelator), RNase, Tris 등이 함유되어 있다.

    <중 략>

    Nanodrop 분석 결과 4조는 1번 plasmid DNA는 농도가 다른 조에 비해 꽤 높은 편인 206.3 ng/µL가 나왔고 2번 plasmid는 다른 팀에 비해 DNA 농도가 낮은 편인 38.9 ng/µL가 나왔다.
    A260/A280 비율의 수치는 단백질에 대한 핵산의 양을 나타낸다. 순수하게 정제된 RNA나 DNA는 각각 2.1과 1.8의 수치를 나타낸다. 비율이 낮을수록 단백질의 함량이 높다는 의미이며 높은 단백질 함량은 핵산을 이용하는 실험에 영향을 미칠 수 있다. 모든 조에서 A260/A280 비율은 1.8보다 높기 때문에 단백질 함량이 높지 않게 분리가 잘 되었다는 것을 알 수 있다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 인천대학교 나노바이오실험(1) A 자료) 4. Plasmid perp & Gel Electrophoresis

    목차

    1. 실험 일시 및 장소
    2. 실험 도구
    3. 이론
    4. 실험 목표
    5. 실험 방법
    6. 결과
    7. 고찰
    8. 출처

    본문내용

    2. 실험 도구
    – 실험 기자재 : 마이크로 피펫 & 마이크로 피펫 팁 (1000 μL, 200 μL), tube (10 mL, 50 mL), tube rack, 라텍스 장갑, microwave, UV lamp, nano drop, 전기영동장치, shaking incubator, vortex mixer, centrifuge, 스티로폼 박스, 삼각플라스크
    – 시약 : E.coli 배양액, agarose powder, TAE buffer, 6X loading dye, isopropanol, 70% EtOH, gel electrophoresis buffer, EtBr, DW, P1, P2, P3 solution, ice

    3. 이론
    ① Plasmid DNA
    세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA이다. 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다.
    ② Plasmid DNA를 추출하는 방법
    Ⅰ. 크기 차이를 이용한 plasmid 추출 및 정제 방법
    유전체 DNA가 절단되지 않도록 매우 조심히 수행하여야 한다. 먼저, EDTA, 라이소자임 및 25% 자당(sucrose) 용액을 처리하여 세포벽이 부분적으로 파괴된 원형질체를 형성한 후, 비이온성 계면활성제인 Triton X-100을 첨가하여 세포를 용해시킨다. 이후, 원심분리를 통해 상층액에 있는 플라스미드를 추출하게 된다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • [일반생물학실험]Plasmid DNA – 전기영동

    목차

    1. 실험 목적
    2. 실험 이론 및 원리
    3. 실험 기구 및 시약
    4. 실험 방법
    5. 주의 사항
    6. 실험 결과
    7. 참고 문헌

    본문내용

    1. 실험 목적
    가. 제한효소를 통해 절단된 plasmid DNA를 전기영동을 통해 확인한다.
    나. 전기영동을 함으로써 그 원리와 방법을 익히도록 한다.

    2. 실험 이론 및 원리
    가. DNA 전기영동
    DNA를 크기에 따라 분리하기 위해 DNA 전기영동을 하는 것이다. DNA는 기본골격에 있는 인산기 때문에 전기영동에 사용되는 완충용액 속에서 (-)전하를 띠고 있어서 두 전극 사이에 위치해 있을 때 50V～100V 정도의 전류를 흘려주게 되면 (+)극 쪽으로 움직이게 된다. 이 때 gel은 그물모양으로 엮여있기 때문에 DNA 분자가 gel을 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지며 젤의 밀도가 클수록 늦어진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoil된 DNA는 선형 DNA 보다 빠르게 움직인다고 알려져 있다.

    출처 : 해피캠퍼스