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  • SDS-PAGE

    목차

    1. Summary
    2. Introduction
    3. Material and Methods
    4. Result and Discussion
    5. Reference

    본문내용

    1) SDS PAGE

    SDS PAGE의 정식 명칭은 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis이며 주로 내분비학, 유전학, 생화학, 분자생물학 등 단백질을 연구하는 학문에 많이 사용된다. 단백질을 분리해내는 기술로, 전기영동 이동성을 이용한 기술이다. 여기서 전기영동 이동성이란 polypeptides sequence의 길이, 분자량, 3차원 접힘 구조 등과 같은 다른 요인들에 의해 나타나는 특성이다.

    핵산을 전기 영동할 때는 보통 agarose gel을 이용하지만 단백질 전기영동을 할 때에는 polyacrylamide를 matrix로 이용한다. acrylamide를 촉매 반응을 통해 polyacrylamide로 만든다. 이때, 촉매로는 ammonium persulfate와 TEMED 효소를 사용한다.
    N,N’-methylenebisacrylamide, acrylamide monomer와 촉매가 만나 그물 형태를 만들게 되는데 이를 polyacrylamide라고 한다. 이는 효소를 이용한 반응이었기 때문에 agarose gel을 사용할 때와는 다르게 비가역적이다.

    SDS는 음이온성 계면활성제 중 하나이다. SDS는 단백질과 소수성 결합을 형성한다. 평균적으로는 polypeptide 사슬 1에 대하여 1.2~ 2개 정도의 SDS 분자가 결합하는 것으로 알려져 있다. 단백질은 그것을 구성하는 아미노산에 의해 양이온이나 음이온과 같은 전하를 띄게 된다. 하지만 SDS를 처리하면 비가역적으로 polypeptide 사슬이 균일하게 음전하를 띄게 된다. 따라서 모든 분자를 양극으로 이동시키고 gel의 pore 사이즈에 따라서 분자량의 크기에 따라 단백질을 분리하는 게 가능해졌다. 이 때문에 SDS는 native protein을 individual polypeptides로 denature 하는 데에 가장 자주 사용되는 agent이다.

    SDS로 인해 단백질은 denature 되는데, 추가적으로 β-mercaptoethanol을 통해 단백질의 folding 구조를 깨서 일자로 만들어준다. 만약 SDS를 사용하지 않는다면, 분자량이 비슷한 다른 단백질들이 protein folding의 차이로 인해서 다르게 이동하는데, folding 방식의 차이에 따라 어떤 단백질들은 gel에서 다른 단백질보다 더 빠르게 이동할 수 있다. SDS를 첨가함으로 이러한 문제점들을 해결하고 선형으로 단백질을 만들어 분자량의 크기에 따라 분리할 수 있게 된다. Size에 따라서 각 단백질은 다르게 gel을 통과하며 작은 단백질은 쉽게 gel의 pore를 통과하고 더 멀리 이동하게 된다. 따라서 정해진 얼마의 시간이 지나면 size 별로 이동성이 다르게 분리되어 있다. 큰 단백질은 시작점에 가까운데 반해 작은 단백질은 더 많이 이동하게 된다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 단백질 분리 및 전기영동

    목차

    1. 실험배경
    1.1 Lysis buffer
    1.2 Bradford assay
    1.3 PAGE

    2. 실험목적

    3. 실험재료 및 방법
    3.1 실험재료
    3.2 실험방법

    4. 실험결과

    5. 고찰

    본문내용

    1.1 Lysis buffer (용해 완충액)
    단백질은 세포막과 세포 안에 존재하기 때문에 세포를 붕괴시켜야 단백질을 얻을 수 있다.
    세포를 붕괴시키기 위한 물리적 방법으로는 세포를 갈아서 세포막을 붕괴시킬 수 있고, 화학적인 방법으로는 세제로 세포막을 붕괴시킬 수 있는데, 이때 이용되는 세제에서도 이온성 세제인 SDS와 비이온성 세제인 NP-40, Triton가 있다.
    Lysis buffer는 세포 화합물을 분석을 위해 개방형 세포를 파괴할 때 사용되는 완충액이다. 대부분의 용해 완충액은 용해물의 산도 및 삼투압을 조절하기 위해 염(NaCl)을 함유한다. 때로는 세제(Triton X-100 또는 SDS)를 첨가하여 막 구조를 해체할 수도 있다. 또한 용해 완충액은 동물과 식물의 조직 세포 모두에서 사용할 수 있다.

    1.2 Bradford assay
    단백질 정량(시료 내에 포함된 단백질 양, 농도를 구하는 과정)법 중 하나로 UV-Visible Spectrophotometer를 이용해 흡광도를 측정하고 standard 물질인 BSA를 기준으로 시료에 단백질이 얼마나 들어있는지 측정할 수 있는 방법이다.
    산성조건에서는 붉은색이었던 염색약이 푸른색으로 변하게 되고 단백질과 결합을 하게된다. coomassie blue가 단백질과 complex를 형성하는 과정에서 coomassie blue가 단백질의 중성을 무너뜨리면서 소수성 부위를 노출시키고, 노출된 단백질의 소수성 부위와 dye가 결합한다. 결합이 강해지면서 coomassie blue dye의 파란색 형태를 안정화 시키게 된다.
    protein-coomassie blue complex수는 단백질의 농도와 비례하며 흡광도와도 비례하게 된다.
    standard curve의 경우 R의 제곱 값이 1에 가까울수록 정확도가 높아져 실험이 잘 진행된 것인지 확인할 수 있다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • 면역학 SDS-PAGE 실험 레포트

    목차

    1.실험제목(title)
    2.실험날짜(date):
    3.실험목적(purpose):
    4.실험 준비물(material-reagent, instrument)
    5.실험 방법(method)
    6.실험 결과(result)
    7.실험 고찰(discussion)
    8.참고문헌(reference)

    본문내용

    · 실험 제목(title): SDS-page와 coomassie blue staining

    · 실험날짜(date):

    · 실험목적(purpose): sds-page를 통해 원하는 단백질의 유무를 확인하고 marker와 비교하여 분자량을 산출해내기 위함이다.

    · 실험 준비물(material-reagent, instrument)
    pipet, tip, 5X sample buffer, coomassie blue, whole protein sample, IP sample(BSA, actin), SDS-page gel, 1X TGS buffer, protein marker, rocker, destaining solution, SDS gel electrophoresis, FBS, PBS

    출처 : 해피캠퍼스

  • [생화학실험] A+, SDS-PAGE를 통한 단백질 분리 실험

    목차

    1. 실험목적
    2. 이론
    3. 실험재료 및 기기
    4. 실험과정
    5. 실험결과
    6. 고찰
    7. Reference

    본문내용

    1. 실험목적
    – SDS-PAGE를 이용한 단백질의 분석 및 검출을 진행하고 이해한다.
    – SDS-PAGE에 사용되는 시약의 특성을 알압보고 SDS-PAGE의 원리를 이해한다.

    2. 이론
    ◼ SDS-PAGE
    – SDS-polyacrylamide gel electrophoresis로, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 약호이다.
    – Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)으로서 단백질이 전기장이 가해진
    겔(gel)에서 그 크기에 따라 이동속도가 다름을 이용해 이들을 분리 및 분석하는 기법이다.
    – 전기장에서 단백질 등을 분리하는 것을 전기영동이라고 하는데, SDS-PAGE가 가장 많이 쓰이는 방법
    이다.
    – 도데실 황산 소듐은 단백질을 분리하기 전에 단백질을 똑같은 직선 형태로 변성시키며 아울러 단백질
    에 음의 전하를 띠도록 한다. 단백질은 전기를 띤 젤을 따라 움직이며 분자량이 작은 단백질은 빠르게
    움직인다. 젤을 염색하면 분자량이 다른 단백질들은 뚜렷한 띠로 구분된다.

    ◼ SDS (Sodium dodecyl sulfate, 도데실황산소듐)
    – 음이온 계면활성제(anionic surfactant)이다.
    – 소수성 꼬리와 친수성 머리 구조를 갖고 있어서 단백질과 결합하면 단백체 변성을 일으킨다.
    → 세포막 단백체처럼 일반적인 완충액에 쉽게 용해되지 않는 단백체의 분리 분석용 시료로 사용되고
    있다.
    – RNA, DNA를 추출하는 과정에서 세포를 부수는 세포 용균으로 사용되기도 하고, 단백질을 변성시키
    는 데 사용되기도 한다.

    출처 : 해피캠퍼스

  • [일반생물학실험]전기 영동

    목차

    1. 실험 목적

    2. 실험 이론 및 원리
    1) 실험 배경

    3. 실험 기구 및 시약
    1) 실험 재료

    4. 실험 방법
    1) 실험 과정

    5. 실험 결과
    1) SDS-PAGE and Staining

    6. 토의 사항
    1) 실험 고찰

    본문내용

    1. 실험 목적
    1.1. 단백질 전기영동의 원리를 이해한다.

    2. 실험 이론 및 원리
    2.1. 실험 배경
    전기영동의 원리는 단백질 분자들은 표면의 여러 부위에 양전하 또는 음전하를 띄고 있어, 단백질 혼합액 속에 전극을 설치하고 직류전압을 가하면 음극 또는 양극으로 이동하게 된다. 이처럼 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 전기영동이라고 한다. 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용익의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류등 여러가지 요인에 따라 결정된다. 이러한 성질에 의해 전기영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 등과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는데 매우 효과적인 방법으로 이용된다.
    전기영동법은 여러 종류가 있는데, 첫 번째로는 이동계면 전기영동법이다.

    출처 : 해피캠퍼스